鸭源致病性大肠杆菌的分离鉴定及致病性观察

来源：兽药直销网  发布日期：2012-04-30  发布者：晓天  共阅681次

鸭大肠杆菌病是影响养鸭场生产效益的主要疾病之一。据文献资料显示［1，2］，鸭大肠杆菌病在我国不同类型的养鸭场中普遍存在，流行广泛，而使用抗生素防治该病，又易产生抗药性，并且从这些报道看，我国分离到的鸭源性大肠杆菌的血清型众多，不同地区差异较大。伴随着规模化养鸭的发展和区域集约化养殖的扩大，加上环境与水源的污染加重，该病的危害日益严重，往往一个场发病，能导致集养区成片流行，而且鸭大肠杆菌病与传染性浆膜炎混合感染较多，症状与病变较相似而不易区分，还具有垂直传播的特点，这都会给养殖户造成重大的经济损失，因此对鸭大肠杆菌病的防治是非常重要的。
本研究从湖北荆州五三农场病变特征为纤维素性心包炎和肝周炎的患病的雏鸭脑内分离到1株细菌， 进行生化特性试验、药敏试验、细菌16SrRNA 序列测定和动物回归试验，鉴定为致病性大肠杆菌，并用已分离鉴定的大肠杆菌经腹腔注射途径感染15 日龄雏鸭，观察雏鸭感染后的临床症状、病理变化，进一步了解此分离菌株的病理变化、致病特点，阐明雏鸭感染大肠杆菌后发病特点，为进一步探讨其发病机理和临床防治提供资料。
1 材料和方法
1．1 试验动物
湖北荆州五三农场送检疑似感染病鸭；1 日龄樱桃谷雏鸭10 羽，购自武汉市畜牧科学研究所。
1．2 大肠杆菌的分离及初步鉴定
用无菌接种环取冻存的麻鸭头的脑，划线接种于普通琼脂和麦康凯琼脂平板，37℃培养18～24 h，在麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落在普通琼脂斜面上进行纯培养，37℃培养18～20 h。再挑取纯培养物涂片、革兰氏染色，观察细菌形态及染色特征。
1．3 生化试验
将符合大肠杆菌形态特征的细菌接种于普通琼脂斜面，37℃培养24 h，挑取适量细菌接种于生化试验微量发酵管（葡萄糖、棉子糖、甘露醇、尿素分解管、赖氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、半固体琼脂、蛋白胨水、硫化氢、枸橼酸盐、侧金盏花醇、木糖、葡萄糖磷酸盐、山梨醇），37℃培养24～72 h，观察并记录结果。
1．4 药敏试验
按照WHO 推荐的纸片扩散法Kirby－Barer 氏法进行［5］，测定大肠杆菌对青霉素、氨苄青霉素、丁胺卡那霉素、氧哌嗪青霉素、丙氟哌酸、头孢肤肟、复方新诺明、复达欣、先锋铋素、先锋霉素Ⅳ、苯唑青霉素、美满霉素、痢特灵、麦迪霉素、强力霉素、奥复星、青霉素17 种常用抗生素药物的敏感性。
1．5 鸭源大肠杆菌的16S rRNA 的PCR 检测
从TSA 平板中挑单菌落于5 mL LB 培养基中，37℃ 200 r ／min 振荡培养3 h，使用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根公司，批号：G5807），按其说明进行基因组DNA 提取。
使用细菌16S rDNA 通用引物［6］， 上游P0：GAGTTTGATCMTGGCTCAG；下游Pc3：CTAHAGGG
TATCTAATCCT 进行扩增，反应体系50 uL，反应条件为95℃ 5min，随后94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 90s，共30 个循环，72℃延伸10 min。扩增产物检测采用常规琼脂凝胶电泳（1％琼脂糖，GENETECH 公司，0．5 μL ／mL EB，0．5×TBE），120V 20 min，使用凝胶成像系统（UVP 公司）观察结果。利用凝胶片段回收试剂盒（天根公司，批号：DP209－02）将阳性条带回收纯化， 常规方法连接pMD－18T 后转化大肠杆菌DH5α，进行测序（Invitrogen 公司）。
1．6 致病性试验
1．6．1 动物分组及处理1 日龄樱桃谷雏鸭10 羽，空白饲养14 d 经血液检查无细菌感染后，于15 日龄随机分为2 组，分别为腹腔组和对照组，每组5羽。鉴定出的大肠杆菌接种于营养肉汤培养基，37℃振荡培养18 h，4 000 r ／min 离心20 min， 用灭菌生理盐水配制细菌浓度为3×108cfu/mL 菌悬液备用。腹腔组雏鸭经腹腔内注射途径接种上述制备大肠杆菌菌悬液，每羽0．5 mL。对照组常规饲养管理，不作处理。
1．6．2 临床症状观察及样品处理感染后每天上、下午各记录一次雏鸭的最早死亡时间和死亡数，剖检观察病变，并以心血、肝脏、脑作细菌分离、鉴定，感染后7 d 扑杀仍存活的雏鸭剖检观察病变并作细菌分离鉴定。采取脾脏、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺、法氏囊置于10％中性福尔马林溶液中固定，备作组织病理学观察。
1．6．3 组织病理学观察对采取的组织进行常规石蜡包埋、切片、HE 染色，最后在光学显微镜下观察结果，并采用NIS－Elements 高清晰度彩色图文分析系统记录。
2 结果与分析
2．1 大肠杆菌的分离及初步鉴定
分离菌的培养特性及形态特征： 经37℃培养24～48 h，在麦康凯琼脂上形成红色、圆形、隆起、光滑湿润、边缘整齐的中等大菌落；在普通琼脂斜面上为灰白色菌落；取培养物涂片，革兰氏染色，镜检能见到革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌。
2．2 生化试验结果
生化试验结果显示分离的大肠杆菌对葡萄糖、尿素、山梨醇、半固体琼脂、赖氨酸、鸟氨酸试验为阳性；硫化氢、葡萄糖磷酸盐、蛋白胨水、侧金盏花醇、棉子糖、苯丙氨酸、枸橼酸盐、木糖试验为阴性。
2．3 药敏试验结果
对分离出的大肠杆菌进行了药敏试验，此次鸭场分离的大肠杆菌对氧哌嗪青霉素、丙氟哌酸、头孢肤肟、复方新诺明、先锋铋素、美满霉素、痢特灵、强力霉素、奥复星、青霉素高度敏感，对丁胺卡那霉素、复达欣中度敏感，对氨苄青霉素、先锋霉素Ⅳ、苯唑青霉素、麦迪霉素耐药。
2．4 鸭源大肠杆菌的16S rRNA 的PCR 结果及测序
PCR 结果在约750bp 处有一特异性条带，如图1。将测序结果与Genbank nr 数据库进行Blast 比对。结果与肠致病性大肠杆菌（E．coli EXPEC，acc：CP001969．1）、鸡源致病性大肠杆菌（E．coli O1∶K1∶H7，APEC，acc：CP000468．1）、尿道致病性大肠杆菌
（E．coli UPEC，acc：CP000243．1）16S rRNA 部分序列均达到100％ 相似性， 与同科的志贺菌属（EU009185）仅有1 个碱基差别，而与肠杆科其他属同源性在98％以下，表明2 个菌属同源性较高。结合培养特征，确定该菌为大肠杆菌。2．5 致病性试验结果
2．5．1 试验雏鸭的发病情况及临床症状 腹腔组雏鸭感染后10 h，雏鸭死亡1 羽，其他雏鸭表现精神不振，头部羽毛蓬松，食欲下降，排黄色稀粪；感染后1 d，眼部分泌物增多，感染后3 d，全部死亡。空白对照组雏鸭精神状态和食欲正常，好动，羽毛光滑，生长速度快，全部存活。
2．5．2 试验雏鸭的眼观病理变化观察结果 腹腔组：肝脏表面有一层黄白色的纤维素附着（图2）且肝被膜与胸壁、心脏、腹膜发生粘连；脾脏呈网格状充血肿大；肾脏肿大，呈紫红色；法氏囊肿大，气囊变浑浊，有少量黄色干酪样分泌物。腹腔和肠管表面均有黄白色的纤维素附着（图3）。对照组：各器官组织无明显眼观病理变化。
2．5．3 试验雏鸭的组织病理变化观察结果 腹腔组：心外膜增厚、淤血，心肌血管淤血；肝被膜增厚，呈浆液纤维素性渗出，内有细菌团块；血管周围间隙增宽，炎性细胞浸润；肺脏淤血，血管周围组织间隙增宽，血管周围有炎性细胞围绕，形成血管袖套现象（图4） 且血管中有大量的细菌团块存在（图5），局部支气管周围有淋巴细胞浸润；肾脏间质及肾小球内有轻微的淤血。对照组：各器官组织无明显组织病理变化。
3 讨论
本研究自湖北荆州五三农场送检的病鸭脑组织中分离出可疑菌株并经一系列实验室诊断，确定本次从病料中分离出的菌株为大肠杆菌，命名为JM株。
鸭大肠杆菌病一年四季均能发生，在冬春寒冷和气温多变季节多发，育雏温度过低也能加重该病的发生，其病原通过污染的蛋壳、鸭的分泌物、排泄物、污染的饲料、水、食具、垫料、粉尘而传播［7］。本试验以腹腔注射途径感染雏鸭，观察分离菌株的致病特点，试验结果显示经腹腔注射途径感染的雏鸭在感染3 d 内100％发生死亡，经细菌学检查未发现其他细菌，感染雏鸭的组织病理学观察可见感染雏鸭均表现出纤维素性肝被膜炎，纤维素性心包炎和气囊炎，这与自然条件下大肠杆菌感染引起的病变相同［3，4］。说明此株鸭源大肠杆菌是一株致病性很强的强毒株。此外，感染雏鸭也表现有浆液性肺炎且在肺组织血管内可见大量细菌团块，表明大肠杆菌对感染雏鸭肺脏也产生了病理损伤。
此次分离的大肠杆菌的药物敏感试验显示对氧哌嗪青霉素、丙氟哌酸、头孢肤肟、复方新诺明、先锋铋素、美满霉素、痢特灵、强力霉素等药物均高度敏感，因此可指导临床治疗用药。大肠杆菌很容易产生耐药性，能由染色体或质粒介导，它能通过菌毛将耐药质粒传递给其他大肠杆菌，所以大肠杆菌的耐药性形成较快，环境中大肠杆菌的耐药性菌株越来越多。临床上用药的不合理也容易导致大肠杆菌的耐药菌株的产生［4］。在实际用药中应采取联合、轮换、交叉等用药形式，以减小细菌产生耐药性的几率，达到好的防制效果。

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