恩诺沙星酶联免疫试剂盒质量标

来源：  发布日期：2011-09-03  发布者：晓天  共阅1601次

本品系用恩诺沙星（ENR）偶联蛋白的抗原、恩诺沙星单克隆抗体和酶标记羊抗鼠及其它试剂制成。用于定量、定性检测鸡组织、虾、鱼和鸡血清中ENR残留量。

【物理性状】试剂盒外观完整，内装试剂齐全。包被抗原的酶联板透明干燥且用真空包装，恩诺沙星（ENR）抗体工作液、底物液、终止液、标准品、浓缩洗涤液为透明液体，酶标记物为浅黄色溶液，试剂无菌检验均应合格。

【灵敏度测定】 取已包被好的酶标板12孔，每两孔分别加入0?g/L、0.5?g/L、1.5?g/L、4.5?g/L、13.5?g/L、40.5?g/L标准溶液各50?L，再加入ENR抗体50?L，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干，加入100?L酶标二抗，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光37℃反应15min，用50?L/孔终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值（B）平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）的平均值再乘以100，即百分吸光度值。以ENR浓度（?g/L）的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。

IC50（即0浓度标准溶液的吸光度值50％处所对应的ENR浓度）范围应在1.45?g/L ~3.26?g/L之间。

【特异性测定】 取已包被好的酶标板18孔，每两孔分别加入0?g/L、0.5?g/L、1.5?g/L、4.5?g/L、13.5?g/L、40.5?g/L标准溶液和阴性鸡肉样本提取液、10?g/kg和20?g/kg 两个浓度ENR标准品添加的阳性鸡肉样本提取液各50?L，再加入ENR抗体50?L，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干，加入100?L酶标二抗，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光37℃反应15min，用50?L终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值（B）平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以ENR浓度（?g/L）的自然对数为X轴，百分吸光度为Y轴，绘制标准曲线图。从标准曲线中查出阴性样品和10?g/kg和20?g/kg 两个浓度ENR添加的组织样品的测定浓度。

阴性样品测定值均应在2.5?g/kg以下，10?g/kg和20?g/kg 两个浓度ENR添加样本回收率应在60%~110%之间。

【精密度测定】 取已包被好的酶标板32孔，每两孔分别加入0?g/L、0.5?g/L、1.5?g/L、4.5?g/L、13.5?g/L、40.5?g/L标准溶液50?L，其它20孔加入4.5?g/L的标准溶液50?L，再加入ENR抗体50?L，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干，加入100?L酶标二抗，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光37℃反应15min，用50?L终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。

20个微孔的4.5?g/L标准溶液的吸光度值的变异系数（%）应≤25%（n=20）。

【适用范围】用于定量、定性检测鸡组织（肌肉、肝脏等）、虾、鱼和鸡血清中ENR残留量。

【用法和结果判定】

1. 溶液的配制

1.1 0.1MNaOH溶液 　 0.4g　　 NaOH

　　　　　去离水100ml溶解

1.2 乙腈NaOH溶液　 将乙氰与0.1M NaOH溶液按84：16的体积比混合

1.3 PB缓冲液配制　 　0.52g　 Na2HPO4·12H2O

　　　　　　　　 　　 0.088g　 NaH2PO4·2H2O

去离水100ml溶解

1.4 稀释洗涤液 将20X浓缩洗涤液摇匀，用去离子水以1：20的比例稀释，临用前配制。

2.　 样品前处理

2.1　 鸡组织（肌肉、肝脏等）样本处理方法

2.1.1 称取2.0g均质过的鸡肉样本于50mL离心管中。

2.1.2 加入乙腈 NaOH溶液10mL，充分混合10min，3000g以上，15℃离心10min。

2.1.3 取出5mL上清液，加入0.02M PB缓冲液2mL，混合均匀。

2.1.4 加入二氯甲烷5mL，充分混匀10min，3000g以上，15℃离心10min。去上层，取下层有机相到干燥瓶中（清亮无杂质），50℃旋转蒸发至干或氮气吹干。

2.1.5 用0.6mL 0.02M PB缓冲液溶解干燥的残留物，加入正己烷1mL，混合2min，3000g, 15℃离心5min。

2.1.6 轻吸掉上层有机相和中间部份液体，取下层50μL溶液，再加入150μL 0.02M PB缓冲液混匀即可分析。

2.2 鸡血清样本处理方法

2.2.1 用加有肝素钠（20~30单位/mL血）的离心管采集血样本，血样本室温静置1h，待析出血清后3000g，15℃离心10min，取出血清1mL。

2.2.2 加入3mL乙腈充分上下混合10min，3000g以上，15℃离心10min。转移上清至另一离心管中，加入1mL 0.02M PB缓冲液，混匀。

2.2.3 加入二氯甲烷4mL，充分混匀10min，3000g, 15℃离心10min。去上层，取下层有机相到干燥瓶中（清亮无杂质），50℃旋转蒸发至干或氮气吹干。

2.2.4用0.6mL 0.02M PB缓冲液溶解干燥的残留物，加入正己烷1mL混合2min，取出3000g以上，15℃离心5min。

2.2.5 轻吸掉上层有机相和中间白色杂质，取下层50μL溶液，再加入150μL PB缓冲液混匀即可分析。

2.3 水产品样本的处理等同于鸡组织样本的处理方法

注：水产品提取中上述第1.2.5步，如果在两相之间出现太多的泡沫或胶状物，难以取出足够的下层提取液，应将样品瓶放在80℃水浴中5min后再离心。

3.　 检测步骤

3.1 将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出，置室温（20~24℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

3.2 按需要取好微孔条及板架，将不用的微孔板重新密封，保存于2~8℃，不要冷冻。

3.3 编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔。

3.4 加标准品或样本 50 mL /孔，然后加抗体工作液50 μL/孔，用盖板膜盖板，37℃水浴或恒温箱反应30min。

3.5 取出用洗涤液按每孔250μL，洗板4~5次，每次浸泡10秒，拍干。

3.6 加酶标记物工作液，每孔100mL，用盖板膜盖板后置37℃水浴或恒温箱反应30min。取出用洗涤液按每孔250μL，洗板4~5次，每次浸泡10秒，拍干。

3.7 显色：每孔加入底物液A液50mL，再加B液50mL，轻轻振荡混匀，37℃水浴或恒温箱避光显色15min。

3.8 测定：每孔加入2M终止液50mL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定吸光度值（OD值）。

4.　 结果判定

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

百分吸光度值（%）＝
B
×100%

B0



B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0?g/L标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以恩诺沙星标准品浓度（?g/L）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中恩诺沙星实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

【贮藏条件和保存期】

试剂盒应在2~8℃保存，保存期为6个月。

【规格】 每个试剂盒含96孔板一块，ENR标准品6瓶 1mL/瓶（0?g/L、0.5?g/L、1.5?g/L、4.5?g/L、13.5?g/L、40.5?g/L），ENR抗体工作液1瓶，7mL；酶标二抗工作液1瓶，12mL；浓缩洗涤液1瓶，40mL；底物液7mL各一瓶；终止液1瓶，7mL/瓶；盖板膜1张，自封袋1个；说明书1份；质量报告1份。

【注意事项】

1、剂盒在缓冲液配制和液体分装上要做到无菌，防止试剂变质。

2、试剂盒标准品应经过严格配制后方可用于试剂盒中。

3、添加回收用的高浓度标准品需经过试剂盒自身标准验证，合格后方可用于特异性和准确度监控用。

4、严格按照质量标准所述用法和结果判定内容进行试剂盒质量控制。

5、在试剂盒老化实验中出现有不合格现象，则视该批试剂盒为不合格。

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