氟喹诺酮类药物酶联免疫试剂盒质量标准

来源：  发布日期：2011-09-03  发布者：晓天  共阅1462次

本品系用氟喹诺酮类药物（QNS）偶联蛋白成为抗原、氟喹诺酮类药物类单克隆抗体和酶标记羊抗鼠及其它试剂制成。用于定量、定性检测鸡组织、虾、血清等样本中氟喹诺酮类药物的残留量。

【物理性状】 试剂盒外观完整，内装试剂齐全。包被抗原的酶联板透明干燥且用真空包装，氟喹诺酮类药物（QNS）抗体工作液、标准品溶液、底物液A液、底物液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液为透明溶液，酶标记物为浅黄色溶液，试剂无菌检验均应合格。

【灵敏度测定】 取已包被好的酶标板12孔，每两孔分别加入0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、81?g/L标准溶液各50?L，然后加抗体工作液50 mL/孔，用盖板膜盖板，37℃环境中反应30min，取出用洗涤液按每孔250μL，洗板4～5次，每次浸泡10秒，用吸水纸拍干，加酶标物每孔100mL，用盖板膜盖板，置37℃环境中反应30min。取出用洗涤液按每孔250μL，洗板4～5次，每次浸泡10秒，用吸水纸拍干。每孔加入底物液A液50mL，再加B液50mL，轻轻振荡混匀，37℃环境避光显色15min。用50?L终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。每个浓度标准溶液吸光度值（B）平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以环丙沙星浓度（?g/L）的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。

IC50（即0浓度标准溶液的吸光度值50％处所对应的环丙沙星浓度）范围应在3.93?g/L ~5.49?g/L之间。

【特异性测定】 取已包被好的酶标板18孔，每两孔分别加入0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、81?g/L标准溶液和阴性鸡肉样本提取液、20?g/kg和50?g/kg 两个浓度环丙沙星添加的阳性鸡肉样本提取液各50?L，然后加抗体工作液50 mL/孔，用盖板膜盖板，37℃环境中反应30min，取出用洗涤液按每孔250μL，洗板4～5次，每次浸泡10秒，用吸水纸拍干。加酶标记物每孔100mL，用盖板膜盖板后置37℃环境中反应30min。取出用洗涤液按每孔250μL，洗板4～5次，每次浸泡10秒，用吸水纸拍干。每孔加入底物液A液50mL，再加B液50mL，轻轻振荡混匀，37℃环境避光显色15min。用50?L终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。每个浓度标准溶液吸光度值（B）平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以环丙沙星浓度（?g/L）的自然对数为X轴，百分吸光度为Y轴，绘制标准曲线图。从标准曲线中查出阴性样品和20?g/kg和50?g/kg 环丙沙星添加的组织样品的测定浓度。

阴性样品测定值在4?g/kg以下，按20?g/kg 和50?g/kg 两个浓度分别将环丙沙星对鸡肉、鸡肝、虾、血清进行添加，回收率应在50.0%~130.0%之间。

【精密度测定】 取已包被好的酶标板32孔，每两孔分别加入0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、81?g/L标准溶液50?L，其它20孔加入9?g/L的标准溶液50?L，，然后加抗体工作液50 mL，用盖板膜盖板，37℃环境中反应30min，取出用洗涤液按每孔250μL，洗板4~5次，每次浸泡10秒，用吸水纸拍干。加酶标物每孔100mL，用盖板膜盖板后置37℃环境中反应30min。取出用洗涤液按每孔250μL，洗板4～5次，每次浸泡10秒，用吸水纸拍干。每孔加入底物液A液50mL，再加B液50mL，轻轻振荡混匀，37℃环境避光显色15min。用50?L终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。

20个微孔的9?g/L标准溶液的光吸收值变异系数（%）应≤25%（n=20）

【适用范围】　用于定量、定性检测鸡组织（肌肉、肝脏等）、虾、血清等样本中氟喹诺酮类药物的残留量。

【用法和结果判定】

1.溶液配制：

1.1 PB溶液的配制：称取磷酸氢二钠2.58g磷酸二氢钠0.44g溶于500ml去离子水中。

1.2 稀释浓缩复溶液：将2X浓缩复溶液摇匀，用水以1：2的比例稀释，临用前配制。

1.3 稀释浓缩洗涤液：将20X浓缩洗涤液摇匀，用水以1：20比例稀释，临用前配制。

2.　 样品前处理

2.1　 鸡组织(肌肉、肝脏等)、虾样本处理方法

2.1.1称2.0g均质过的组织样本于50mL离心管中。

2.1.2加入乙腈─NaOH溶液10mL。充分混合10min，3000g以上，15℃离心10min。

2.1.3取上层液5mL，加入5mL的PB缓冲液，再加入正己烷4mL，混合2min，3000g以上，15℃离心10min，除去上层有机相。

2.1.4加入二氯甲烷8mL，充分混匀10min，3000g以上， 15℃离心10min。去上层，取下层有机相移到干燥瓶中（清亮无杂质），50℃旋转蒸发至干或用氮气吹干。

2.1.5用0.6mL稀释了的复溶液溶解干燥的残留物，加入正己烷1mL混合2min，取出3000g以上，15℃离心5min。

2.1.6轻吸掉上层有机相和中间部份液体，取下层50mL+50mL稀释了的复溶液混匀即可分析。

2.2　 鸡血样本处理方法

2.2.1 用加有肝素钠（20~30单位/mL血）的离心管采集鸡血样本（采血注射器也用肝素钠润洗），血样本室温静置1h，待析出血浆后3000g以上，15℃离心10min，取出血浆/血清1mL。

2.2.2 加入乙腈4mL充分混合10min，3000g以上，15℃离心10min。

2.2.3 移上清至另一离心管中，加入2mL PB缓冲液，混匀。

2.2.4 加入二氯甲烷5mL，充分混匀10min，3000g以上， 15℃离心10min。去上层，取下层有机相到干燥瓶中（清亮无杂质），50℃旋转蒸发至干或用氮气吹干。

2.2.5 用0.6mL 稀释了的复溶液溶解干燥的残留物，加入正己烷1mL混合2min，取出3000g以上，15℃离心5min。

2.2.6 轻吸掉上层有机相和中间白色杂质，取下层50mL和50mL稀释了的复溶液混匀即可分析。

3.　 检测步骤

3.1 将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20~24℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

3.2 按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔条重新密封，保存于2~8℃。

3.3 编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔。

3.4 加标准品或样本 50mL，然后各加入抗体工作液50mL，用盖板膜盖板，37℃环境中反应30min。

3.5 取出用稀释后的洗涤液按每孔250μL，洗板4~5次，每次浸泡10秒，用吸水纸拍干。

3.6 加酶标记物，每孔100mL，用盖板膜盖板后置37℃环境中反应30min。取出用洗涤液按每孔250μL,洗板4~5次，每次浸泡10秒，用吸水纸拍干。

3.7 显色：每孔加入底物液A液50mL，再加B液50mL，轻轻振荡混匀，37℃环境避光显色15min。

3.8 测定：每孔加入终止液50mL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定吸光度值（OD值）。

4．结果判定

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。


B


百分吸光度值（%）＝
—
×100%


B0



B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0?g/L标准溶液的平均吸光度值

以环丙沙星浓度的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。

【贮藏条件和保存期】试剂盒应在2~8℃保存，保存期为6个月。

【规格】 每个试剂盒含96孔板一块；环丙沙星标准品6瓶，1mL/瓶（0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、 81?g/L）；QNS抗体工作液1瓶，10mL；酶标记工作液1瓶，12mL；20倍浓缩洗涤液1瓶，40mL；2X浓缩复溶液1瓶，50ml；底物液A液1瓶，7mL；底物液B液1瓶，7mL；终止液1瓶，7mL；高浓度标准品（1?g/mL）1瓶，1mL；盖板膜1张；自封袋1个；说明书1份；质量报告1份。

【注意事项】

1、试剂盒在缓冲液配制和液体分装上要做到无菌，防止试剂变质。

2、试剂盒标准品应经过严格配制后方可用于试剂盒中。

3、添加回收用的高浓度标准品需经过试剂盒自身标准验证，合格后方可用于特异性和准确度监控用。

4、格按照质量标准所述用法和结果判定内容进行试剂盒质量控制。

5、在试剂盒老化实验中出现有不合格现象，则视该批试剂盒为不合格。

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