四环素类药物酶联免疫检测试剂盒质量标准

来源：  发布日期：2011-09-03  发布者：晓天  共阅1486次

本品系用四环素类药物检测抗原、兔抗四环素类药物特异性抗体和酶标羊抗兔IgG的抗体及其他试剂制成。用于检测牛奶和动物组织中四环素类药物残留量。

【物理性状】 试剂盒外观完整，内装物品齐全。抗体、标准溶液、酶结合物、缓冲液1、缓冲液2、缓冲液3和缓冲液4为无色透明液体，底物为浅黄色溶液。

【灵敏度测定】 50%抑制浓度（即0浓度标准溶液的吸光度值50%处所对应的四环素类药物浓度）范围应在2.3?g/L ~3.7?g/L 之间。

【特异性测定】 分别测定空白样品和100?g/L（kg）四环素添加组织样品，阴性样品测定值应在10?g/L（kg）以下，添加药物样品回收率应在40%-120%之间。

【精密度测定】 20个微孔的3?g/L标准溶液的光吸收度值变异系数(%)应不高于20%（n=20）。

【适用范围】 用于检测牛奶、鸡、鱼、猪和牛组织中四环素、金霉素、土霉素和多西环素残留量。

【用法及结果判定】

1．溶液的配制

1.1 20mmol/L草酸甲醇溶液：称取草酸1.8克，加甲醇900mL溶解，稀释至1000mL。

1.2 MCI缓冲液：称取柠檬酸12.9g，磷酸氢二钠10.9g，已二胺四乙酸二钠37.2g，加水900mL溶解，调pH至 3.8，稀释至1000mL。

1.3 1mol/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠40g溶于1000mL水中，混匀。

1.4 3%三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸30g溶于1000mL水中，混匀。

1.5 稀释标准溶液：分别吸取各浓度的标准溶液各50?L，加入450?L缓冲液1，混匀。

1.6 洗液：将缓冲液2稀释10倍，洗板及稀释抗体和酶结合物时使用。

1.7 稀释抗体浓缩液：用洗液将抗体浓缩液10倍稀释（做整块板时，取抗体浓缩液0.5mL，加4.5mL洗液，混匀）。

1.8 稀释酶结合物浓缩液：用洗液将酶结合物浓缩液10倍稀释（做整块板时，取酶结合物浓缩液1mL，加9mL洗液，混匀）。

1.9 底物溶液的配制：用缓冲液3稀释底物10倍，根据用量现配现用，底物溶液变蓝时禁止使用。

2. 样品前处理

2.1 牛奶：新鲜的牛奶或冻融的牛奶用缓冲液1稀释10倍作为试样溶液供酶联免疫法测定（50?L牛奶样品，加450?L缓冲液1）。

2.2 组织提取方法1（鸡肌肉）：

称取匀质（以10000r/min匀浆1min）的肌肉2.0g，加入MCI缓冲液8.0mL，于漩涡振荡器上混匀，颠倒振荡30min，以10000r/min离心10min，取上清液备用（如上清液仍然浑浊，可用滤纸过滤）。

依次用无水甲醇3mL、水2mL活化C18固相萃取柱。取备用液5.0mL过柱，再用水2mL淋洗萃取柱，将萃取柱挤干。用20mmol/L草酸甲醇溶液1.0mL洗脱，收集洗脱液，挤干萃取柱。将洗脱液摇匀，用缓冲液1稀释10倍作为试样溶液供酶联免疫法测定（吸取洗脱液50?L，加入450?L缓冲液1，摇匀）。

2.3 组织提取方法2（鱼肉、猪、牛组织）：

称取匀质（以10000r/min的速度匀浆1min）的组织1.0g，加入3%三氯乙酸（鱼肉、猪肉和牛肉4mL，猪肝和牛肝8mL），旋涡混匀，颠倒振荡20min，以10000r/min离心10min，取上清液200?L于1.5mL离心管中，加入1mol/L氢氧化钠溶液20?L，混匀，加入缓冲液1 780?L混匀，以8000 r/min离心5min，上清液备用。

3.检测步骤

3.1 使用前将试剂盒恢复室温（19℃~37℃）。

3.2 剪开锡箔袋，取所需微孔板条的数量，插入框架。

3.3 依次向微孔中加入标准溶液或试样溶液50?L，稀释的抗体50?L，在微型震荡器上充分混匀后，用封口膜封好，室温孵育1h。

3.4 倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体。加洗液250?L于微孔内，稍后倒出孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，如此重复操作洗板三次。

3.5 加入稀释的酶结合物100?L，室温孵育30min。

3.6 重复步骤4。

3.7 加底物溶液100?L，室温避光孵育5~15min。

3.8 每孔加终止液100?L，于450nm波长处测定吸光度值，60min内读数。

4. 结果判定




按下式计算百分吸光度值：

B—为标准溶液或样品溶液的平均吸光度值。

B0—为0浓度的标准溶液平均吸光度值。

以标准溶液中四环素浓度的对数为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线，从标准曲线上计算出试样溶液中四环素类药物的浓度。

【注意事项】

1．实验操作应在19~37℃的温度下操作。

2．0标准液吸光度值大于或等于0.6。

【贮藏条件和保存期】 在2~8℃下避光保存，保存期为6个月。

【规格】 96孔/盒。每个试剂盒含96孔板一块，四环素类药物系列标准溶液（1mL/瓶）稀释后浓度分别 （0，0.3?g/L， 1?g/L，3?g/L，10?g/L，30?g/L），酶结合物浓缩液（1.5mL），抗体浓缩液(1mL)，底物溶液(1.5mL)，缓冲液1(25mL)，缓冲液2(25mL)， 缓冲液3(15mL)，盖板膜1张。

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