磺胺类药物多残留酶联免疫试剂盒质量标准

来源：  发布日期：2011-09-03  发布者：晓天  共阅1577次

本品系用磺胺类药物（SAs）偶联的抗原、SAs单克隆抗体和酶标记羊抗鼠及其它试剂制成。用于定量、定性检测鸡组织、鸡蛋、尿、蜂蜜等样本中磺胺类药物的残留量。

【物理性状】试剂盒外观完整，内装试剂齐全。包被抗原的酶标板透明、干燥且用真空包装，磺胺类药物（SAs）抗体工作液、底物液、终止液、标准品溶液、浓缩洗涤液、浓缩提取液为透明溶液，酶标记物为浅黄色溶液。试剂无菌检验均应合格。

【灵敏度测定】 取已包被好的酶标板12孔，每两孔分别加入0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、81?g/L标准溶液各20?L，然后加入酶标记物各50?L，再加入SAs 抗体工作液各80?L，用盖板膜盖板，25℃反应1h，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光25℃反应20～30min，用50?L终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值（B）平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以SAs浓度（?g/L）的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。

IC50（即0浓度标准溶液的吸光度值50％处所对应的SAs浓度）范围应在1.64?g/L ~3.54?g/L之间。

【特异性测定】 取已包被好的酶标板18孔，每两孔分别加入0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、81?g/L标准溶液和阴性鸡肉样本提取液、50?g/kg 和100?g/kg 磺胺二甲基嘧啶添加的阳性鸡肉组织样本提取液各20?L，加入酶标物50?L，再加入SAs抗体工作液80?L， 25℃反应1h，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光25℃反应20～30 min，用50?L终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值平均值（B）除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以SAs浓度（?g/L）的自然对数为X轴，百分吸光度为Y轴，绘制标准曲线图。从标准曲线中查出阴性样品和50?g/kg和100?g/kg 磺胺二甲基嘧啶添加的鸡肉组织样品的测定浓度。

阴性样品测定值在2?g/kg以下，50?g/kg 和100?g/kg两个浓度磺胺二甲基嘧啶添加回收率在65.0%～120.0％之间。　

　 【精密度测定】 取已包被好的酶标板32孔，每两孔分别加入0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、81?g/L标准溶液20?L，其它20孔加入9?g/L的标准溶液20?L，再加入酶标物50?L，再加入SAs 抗体工作液80?L，25℃反应1h，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光25℃反应20～30 min，用50?L终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。

20个微孔的9?g/L标准溶液的吸光度值变异系数（%）应≤25%（n=20）。

【适用范围】 用于定量、定性检测鸡组织（肌肉、肝脏等）、鸡蛋、蜂蜜、尿液等样品中磺胺类药物的残留量。

【用法和结果判定】

1. 溶液的配制

1.1 2M NaCL溶液：称取11.69gNaCL　 加入100mL水溶解。

1.2 稀释提取液：将20X浓缩提取液摇匀，用水以1：20的比例稀释，临用前配制。

1.3 稀释洗涤液：将20X浓缩洗涤液摇匀，用水以1：20的比例稀释，临用前配制。

2. 样本前处理

2.1 鸡组织（肌肉、肝脏等）样本处理方法

2.1.1 取适量鸡组织，用匀浆机10000r/min匀浆1 min，称取5±0.05g匀浆物置离心管中，加入15mL乙腈－水溶液（84+16，v/v）混合，剧烈振荡10min。于15℃，3000g以上速度离心10min。

2.1.2 取3mL上清液，加入2mL水和5mL乙酸乙酯，混合振荡10min，15℃，3000g以上速度离心5min。

2.1.3 将上层液移另一管中用氮气吹干（或鸡心瓶中，50℃减压蒸干）。

2.1.4 用异辛烷或正己烷1mL溶解干燥的残留物，加入稀释了的提取液1mL振荡2min。15℃，3000g，离心5min，除去上层液。

2.1.5 取20μL水相进行分析。

2.2　 鸡蛋样本处理方法

样本处理方法同动物组织处理方法。

2.3　 蜂蜜样本处理方法

称取1g蜂蜜样本于50mL离心管中，加入2mL PB缓冲液，再加入8mL乙酸乙酯，振荡萃取10min，3000g以上离心10min,取上层液体于50℃下氮气吹干，加1mL稀释了的提取液复溶，取20mL进行分析。

2.4 尿液样本处理方法

2.4.1取2mL尿液，加入8mL乙酸乙酯，震荡萃取10min，3000g以上离心10min,取上层液4mL，于50℃下氮气吹干，加1mL稀释了的提取液复溶。

2.4.2 取20μL进行分析

3. 检测步骤

3.1 将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20~24℃）平衡30min以上, 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

3.2 按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3.3 编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔。

3.4 反应：往酶标板微孔中加标准溶液或样本溶液20?L，加酶标记物50?L，然后加入磺胺类抗体工作液80 ?L，用盖板膜封板，25℃恒温箱中反应1h。倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入250?L洗涤液，30秒后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。

3.5 显色：每孔加入A、B底物液各50?L，轻轻振荡混匀，25℃恒温箱避光显色20~30min。

3.6 测定：每孔加入终止液50mL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定吸光度值（OD值）。

4. 结果判定

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。


B


百分吸光度值（%）＝
—
×100%


B0



B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0?g/L标准溶液的平均吸光度值

以磺胺药物浓度的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业软件，更便于大量样品的快速分析。

【贮藏条件和保存期】试剂盒应在2~8℃保存，保存期为6个月。

【规格】 每个试剂盒含96孔板一块；标准品溶液6瓶，1mL/瓶（0?g/L、1?g/L、3?g/L、9?g/L、27?g/L、 81?g/L）；SAs抗体工作液1瓶，10mL；酶标二抗工作液1瓶，7mL；20倍浓缩洗涤液1瓶，40mL；20倍浓缩提取液1瓶，50 mL；底物液A液1瓶，7mL；底物液B液1瓶，7mL；终止液1瓶，7mL；高浓度标准品（1?g/mL）1瓶，1mL；盖板膜1张；自封袋1个；说明书1份；质量报告1份。

【注意事项】

1、试剂盒在缓冲液配制和液体分装上要做到无菌，防止试剂变质。

2、试剂盒标准品应经过严格配制后方可用于试剂盒中。

3、添加回收用的高浓度标准品需经过试剂盒自身标准验证，合格后方可用于特异性和准确度监控用。

4、格按照质量标准所述用法和结果判定内容进行试剂盒质量控制。

5、在试剂盒老化实验中出现有不合格现象，则视该批试剂盒为不合格。

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