克仑特罗酶联免疫试剂盒质量标准

来源：  发布日期：2011-09-03  发布者：晓天  共阅1665次

本品系用克仑特罗偶联蛋白的抗原，克仑特罗单克隆抗体和酶标记羊抗鼠及其它试剂制成。用于定量、定性检测猪组织和尿液中克仑特罗的残留量。

【物理性状】试剂盒外观完整，内装试剂齐全。包被抗原的酶联板透明干燥且用真空包装。克仑特罗抗体工作液、底物液、终止液、标准品溶液、浓缩洗涤液为透明溶液，酶标记物为浅黄色溶液，试剂无菌检验均应合格。

【灵敏度测定】取已包被好的酶标板12孔，每两孔分别加入0?g/L、0.1?g/L、0.3?g/L、0.9?g/L、2.7?g/L、8.1?g/L标准溶液各20?L，再加入克仑特罗抗体工作液80?L，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干，加入100?L酶标二抗，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光37℃反应15min，用50?L终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值（B）平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以克仑特罗浓度（?g/L）的自然对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。

IC50（即0浓度标准溶液的吸光度值50％处所对应的克仑特罗浓度）范围应在0.25?g/L~0.56?g/L之间。

【特异性测定】取已包被好的酶标板18孔，每两孔分别加入0?g/L、0.1?g/L、0.3?g/L、0.9?g/L、2.7?g/L、8.1?g/L标准溶液和阴性尿样本提取液、1?g/L和2?g/L克仑特罗添加的阳性尿样本提取液各20?L，再加入克仑特罗抗体工作液80?L，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干，加入100?L酶标二抗，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光37℃反应15min，用50?L终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。每一浓度标准溶液吸光度值（B）平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值（B0）的平均值再乘以100%，即百分吸光度值。以克仑特罗浓度（?g/L）的自然对数为X轴，百分吸光度为Y轴，绘制标准曲线图。从标准曲线中查出阴性样品和1?g/L和2?g/L克仑特罗添加的尿样的测定浓度。

阴性尿样本测定值在0.25?g/L以下，1?g/L和2?g/L克仑特罗添加浓度回收率应在55.0%~120.0%之间。



【精密度测定】 取已包被好的酶标板32孔，每两孔分别加入0?g/L、0.1?g/L、0.3?g/L、0.9?g/L、2.7?g/L、8.1?g/L标准溶液20?L，其它20孔加入0.9?g/L的标准溶液20?L，再加入克仑特罗抗体工作液80?L，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干，加入100?L酶标二抗，37℃反应30min，取出洗板5次，拍干。加入底物液各50?L，避光37℃反应15min，用50?L终止液终止反应，置450nm波长处测定吸光度值。

20个微孔的0.9?g/L标准溶液的吸光度值变异系数（%）应≤25%（n=20）。

【适用范围】用于定量、定性检测猪组织（肌肉、肝脏等）和尿液中克仑特罗的残留量。

【用法和结果判定】

1. 溶液配制

1.1 稀释洗涤液：将20X浓缩洗涤液摇匀，用去离子水以1：20的比例稀释，临用前配制。

1.2 0.05M盐酸液： 取盐酸4.2mL，加水至1000mL。

1.3 0.05M磷酸盐缓冲液（pH3.0）：称取磷酸二氢钾6.8g，加水900mL，用稀磷酸调节pH至3.0，用水稀释至1000mL。

1.4 0.5M磷酸盐缓冲液(pH 3.0)： 称取磷酸二氢钾68g，加水900mL，用磷酸调节pH至3.0，用水稀释至1000mL。

2、样品的前处理

2.1猪组织（肌肉、肝脏等）样本处理方法

2.1.1 5.0g粉碎的样品与25mL 0.05M HCL混合，振荡1.5h，以达到均质的目的；

2.1.2 称6g均质物（相当于1g肝脏），加入离心瓶中；

2.1.3 10~15℃，3000g以上的转速离心15min；

2.1.4 转移上清液到另一个离心瓶中，加300?L 1M NaOH混合15min；

2.1.5 加入4mL 0.5M磷酸二氢钾缓冲液pH3.0，简单的混合后在4℃保存，至少1.5h或过夜（非常重要）；

2.1.6 10~15℃，3000g以上的转速离心15min，分离全部上清液（应该是清亮的，非常重要），使其升至室温（20~24℃），然后用RIDA C18柱纯化（见RIDA C18柱纯化步骤）。

2.2 尿样本处理方法

尿样不用处理，取20?L清亮尿样直接测定（如果尿样浑浊一定要过滤或3000g离心15℃，10min直至得到清亮尿样），暂不使用的样品应冷冻保存。

3. RIDA C18柱纯化步骤

3.1 用3mL甲醇（100%）洗涤柱子，流速为1d/s；

3.2用2mL洗涤液洗涤柱子（0.05M磷酸二氢钾缓冲液，pH3.0）；

3.3 样品进柱（肝，肉或组织的全部上清液）；

3.4 用2mL洗涤液洗涤柱子（0.05M磷酸二氢钾缓冲液，pH3.0）；

3.5 用正压去除残留的流体并且用空气或氮气吹2min干燥柱子；

3.6 用2mL甲醇（100%）洗脱样品，流速为15d/min；

3.7 用50~60℃的弱空气或氮气流下完全蒸发溶剂；

3.8用1mL去离子水溶解干燥的残留物，取20?L进行分析。

4.　 检测步骤

4.1 将试剂盒从4℃冷藏环境中取出并将所需试剂从盒中取出，置于室温（20~24℃）平衡30 min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

4.2 取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2~8℃，不要冷冻；

4.3 编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做2孔；

4.4 反应：往酶标板微孔中加标准溶液或试样溶液20?L，然后加入已稀释好的克仑特罗抗体工作液80?L，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min。

4.5 倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入250?L洗涤液，15s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次。

4.6 加酶标记物：加入酶标记物100?L，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min。取出酶标板，如前述洗板5次；

4.7 显色：每孔加入A、B底物液各50?L，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15min；

4.8 测定：每孔加入终止液50?L，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测），测定每孔吸光度值（OD值）。

5、结果判定

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝
B
×100%

B0



B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0?g/L标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以克仑特罗标准品浓度的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中克仑特罗实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

【贮藏条件和保存期】试剂盒应在2~8℃保存，保存期为6个月。

【规格】每个试剂盒含96孔板1块；克仑特罗标准品6瓶，1mL/瓶（0?g/L、0.1?g/L、0.3?g/L、0.9?g/L、2.7?g/L、8.1?g/L）；克仑特罗抗体工作液1瓶，7mL；酶标记物工作液1瓶，12mL；20倍浓缩洗涤液1瓶，40mL；底物液A液1瓶，7mL；底物液B液1瓶，7mL；终止液1瓶，7mL；高浓度标准品（1?g/mL）1瓶，1mL；盖板膜1张；自封袋1个；说明书1份；质量报告1份。

【注意事项】

1、试剂盒在缓冲液配制和液体分装上要做到无菌，防止试剂变质。

2、试剂盒标准品应经过严格配制后方可用于试剂盒中。

3、添加回收用的高浓度标准品需经过试剂盒自身标准验证，合格后方可用于特异性和准确度监控用。

4、格按照质量标准所述用法和结果判定内容进行试剂盒质量控制。

5、在试剂盒老化实验中出现有不合格现象，则视该批试剂盒为不合格。

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