猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种急性肠道传染病，是导致仔猪早期死亡的重要疫病之一。近年来，猪流行性腹泻的流行区域有逐渐扩大的趋势，已成为中国甚至世界最常见的猪腹泻传染病之一。通过对猪流行性腹泻病毒基因组概述、S基因及其编码蛋白的功能特性、基于猪流行性腹泻病毒S基因的诊断技术及其疫苗研究进展等方面进行综述，以期对猪流行性腹泻病毒S基因研究以及猪流行性腹泻的预防和控制提供帮助。

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猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病。猪流行性腹泻的临床症状以猪水样腹泻、呕吐、脱水为主要特征。其发病特点是日龄越小症状越重，日龄越大症状越轻。本病多发生在春冬两季，不同品种和年龄的猪群均易感染，哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪发病率可达100%，死亡率高达95%以上，给养猪业带来重大经济损失。英国首先于1971年报道了本病的发生，随后比利时、德国、瑞士、日本等许多国家也报道了本病的发生。我国在1976年首次报道了PED的发生，并于1980年首次分离到病毒，以后许多地区均有本病的报道发生。1977年，比利时人从病料中分离出一株不同于TGEV的病毒，并命名为类冠状病毒CV777株。

据报道，在欧洲地区，感染PED的育肥猪和妊娠母猪的临床表现主要是发生轻微的腹泻。相比之前，2000年之后猪流行性腹泻的暴发频率日渐减少，究其原因大都是由于规模化猪场直接采取扑杀销毁病猪的方法，该方法从源头上切断了猪流行性腹泻的扩散，因此在这些地区该病的诊断研究和检测报告也越来越难找到。

在亚洲地区却呈现出不同的现象，PEDV的感染频率一直持续大幅上涨，中国、泰国、韩国、日本感染PED的猪场都遭受到不同程度上的危害。因该病分布广、发病急、对新生仔猪致死率高，给养猪业带来了重大的经济损失。到目前为止,我国已有26个省市自治区报道了PED的发生和流行情况,说明PED在我国己经广泛存在,成为我国重要的猪传染病之一,对国内的养猪业造成了巨大的经济损失。2010年冬季以来，猪流行性腹泻在我国又开始暴发流行，即使免疫商品化疫苗也难于控制，给国内的养猪业造成了重大经济损失。2013年在美国迅速发病并在全美范围内流行，2014年1月已在加拿大开始流行，该病已在世界范围内造成严重影响。

1　PEDV 基因组概述

1955年，第5届国际病毒命名委员会正式将具有冠状病毒典型形态特征的PEDV列为冠状病毒科成员。PEDV基因组属于不分节的具有感染性的单股正链RNA,基因组全长28 kb左右[8],具有5’端的帽子结构(cap)和3’端的Poly (A)尾结构。除末端非编码区序列和3’端Poly (A)尾序列外，剩余基因组主要包括6个开放阅读框（open reading frame, ORF），从5’端到3’端依次为ORF1ab ( 20 000 bp左右)、S基因(4 100 bp左右)、ORF3(670 bp左右)、E基因(230 bp左右)、M基因(680 bp左右)、N基因(1 300 bp左右)。PEDV的结构蛋白主要包括S、E、M、N；复制酶多聚蛋白1ab（ORF1ab）和辅助蛋白（ORF3）是PEDV主要的非结构蛋白，它们仅在病毒侵染和复制过程中表达，最后并不会出现在病毒粒子中。PEDV 中唯一的辅助蛋白是ORF3，它可能与病毒毒力有关，但目前对其了解较少。ORF3基因含有一个大小约为675 nt的开放阅读框，它编码的非结构蛋白相对分子质量约为25.3×103，但是目前该蛋白的具体功能尚不能确定。

1.1　PEDV S基因研究进展

PEDV S基因位于ORF1ab与ORF3之间，由1 383个氨基酸组成，相对分子质量为180×103～220×103。S基因还是病毒主要的免疫原性基因，在诱导机体产生中和抗体的过程中发挥着重要作用。与其他冠状病毒相似，含有27～29个潜在的糖基化位点,当猪流行性腹泻病毒对宿主进行吸附和入侵过程中，S基因起着重要作用。S基因变异性较大,Lee D K等对7株韩国PEDV毒株的S基因进行序列分析发现，相比参考株序列存在15 bp基插入和9 bp缺失,且变异均发生在N末端区域；此外，用不同毒株S基因N端序列做系统进化分析与全基因序列结果具一致性，这提示S基因N端1 100 bp多样性可用于流行毒株的分子流行病学调查和疫苗候选株筛选。例如，不同PEDV毒株中的S1基因中，均存在一段核心表位COE基因(1 495 bp～1 923 bp)，从烟草中获取的或经乳酸杆菌表达的重组COE蛋白均能够与PEDV天然抗原产生相同的反应原性；孙东波用兔抗PEDV多克隆抗体对PEDV S1基因特异性肽库进行生物淘汰，鉴定出3个B细胞抗原表位(248aa-280aa、442aa-499aa、499aa-638aa)，经试验证实，通过E.coli BL21(DE3)系统表达的以上3种不同片段编码的融合蛋白，均能刺激小鼠机体产生中和抗体；为以S基因免疫原性区域作候选基因研发PEDV诊断试剂盒及新型疫苗奠定基础。

1.2　PEDV S蛋白功能特性

S蛋白(spike protein) 是位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白。S蛋白属于1型跨膜糖蛋白，由4部分组成，分别是信号肽区(1-18aa) 、4个中和表位(499-638aa、748-755aa、764-771aa、1 368-1 374aa) 、1个跨膜结构域(1 334-1 356aa) 以及1个短的胞浆区。通过与其他冠状病毒S蛋白同源性的对比，可以将PEDV S蛋白划分为S1(1-798aa), S2(790-1 383aa)2个结构域。S1区包含多个病毒主要中和表位和受体结合域，与病毒抗原性和吸附入侵密切相关。S2区是S蛋白的穿膜部分,具有序列相对稳定的优势，并且在宿主细胞膜与病毒融合的信号转导过程中扮演着重要的角色，其融合活性在病毒对组织的亲和性、对细胞的侵染能力方面起决定性作用。在对同属于冠状病毒科成员的SARS病毒进行研究时发现，其S蛋白的S2区内存在一段七肽重复序列(HR),通过生物信息学分析后得到结论，2个HR结构域(HR1)与(HR2)序列具有高度相似的保守性，它们通过相互作用后形成的六螺旋束能够在病毒入侵细胞时，引起细胞膜和病毒包膜发生重排的现象，最终促使病毒膜融合。此外，研究发现S2蛋白的一个半胱氨酸区域两旁的保守残基C822和C833是重要的活化膜融合位点。这为PEDV S2区膜融合相关结构域的探索和病毒膜融合机制研究提供了参考。同属于冠状病毒科的猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的跨膜受体均是猪氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)。PEDV S1蛋白N端受体的25-88氨基酸亚基区域能特异性地结合pAPN。在PEDV感染细胞培养体系中添加pAPN会明显提高病毒滴度。pAPN的浓度与病毒感染有着密切的关系。为全面地了解病毒入侵机制，应该对PEDV S蛋白pAPN受体进行更深入地研究。在猪传染性胃肠炎病毒方面，Ren等利用肽库筛选得到了多肽，它可以作为新型疫苗候选在体外抑制TGEV的感染。目前在PEDV方面尚未有相关报道，但这值得进行相关的研究。

2　基于PEDV S基因的诊断技术

由于PED与TGE有着极为相似的临床症状和病理变化, 因此确诊PED需要结合实验室诊断方法。目前，用于PEDV检测的方法有许多，比如病毒分离、免疫电镜观察、病毒的中和试验、免疫荧光技术等，这些方法均能对PED做出准确的诊断, 但这些技术操作复杂而且耗时。病毒与宿主细胞吸附和受体识别的主要蛋白之一是S蛋白，且S 蛋白具良好的反应原性和免疫原性，因此在免疫学诊断技术中应用较广。有研究表明，用N蛋白和S蛋白建立ELISA方法分别进行比较探索，发现在免疫测定中S-ELISA法更为有效。研究发现，猪感染猪流行性腹泻后，检测到血清中的抗N蛋白抗体远不及抗S蛋白抗体，可在更长的时间中检测到抗S蛋白的抗体。随着人们对ELISA方法不断地深入研究,该方法被广泛地应用到临床实践中，此方法可用于检测抗体，也可检测抗原，相比较其他检测方法，更为简便、敏感。Gerber等根据PEDV S1蛋白的生物学特性建立了间接ELISA方法，对检测IgA和IgG抗体都具有良好的特异性和敏感性。Paudel等根据PEDV S基因分别表达的S1蛋白、S2蛋白、S3蛋白，分别建立了ELISA方法，对400头免疫疫苗的猪血清进行抗体水平检测，与血清中和试验(SN)相比，S3基因表达蛋白建立的ELISA方法更符合SN，表明S3基因是重要的中和抗原基因,在遗传免疫中起着重要作用。Ishikawa等根据S基因序列设计了一对特异性引物，扩增出854 bp大小的目的片段, 成功地建立了诊断PEDV的RT-PCR法。S基因保守区域也可以作为检测靶点。

3　基于S基因的疫苗研究进展

将PEDV 的S基因在烟草中进行表达，将提取的转基因植物蛋白给小鼠注射，然后进行血清蚀斑减数中和测定，试验结果证明S基因具有良好的免疫原性，通过用这种转基因烟草饲喂小鼠，发现其能够刺激小鼠产生系统免疫和黏膜免疫。以烟草花叶病毒为载体将S蛋白中和表位在无烟碱烟草中进行表达，表达蛋白接种仔猪，发现能够诱导仔猪机体产生保护性免疫反应。这些研究成果为PEDV转基因疫苗的开发与研究奠定了一定基础，但是研究发现，转基因植物自身表达抗原的效率过低，并且其生物安全性也有待进一步考究。通过以重组腺病毒和重组沙门氏菌作为活载体，构建的PEDV疫苗能够针对病毒，产生有效地全身免疫反应和局部黏膜免疫应答。以重组PEDV S1蛋白和N蛋白的干酪乳杆菌给猪和小鼠口服，虽然不能够诱导机体产生中和抗体，但却能激发高水平局部黏膜IgA抗体和非中和抗体的全身免疫反应。由于活载体疫苗存在生物安全性、遗传稳定性尚未确定的缺点，因此国际上商品化的活疫苗不常见。赵德等将PEDV S基因中具有保护性的C-COE基因片段与乳酸菌重组后进行小鼠免疫，前两次间隔1周免疫1次，共进行3次免疫，最后一次免疫间隔2周后进行PEDV抗体检测，试验结果显示以乳酸菌载体制备的疫苗，能刺激机体产生特异性抗体，此外，口服免疫途径比注射产生高水平的抗体更容易，进一步证实乳酸菌载体疫苗更适宜于口服免疫。焦茂兴等将含有PEDV疫苗株的sM、M、S基因与腺病毒进行重组构建了重组腺病毒,研制了PED口服重组腺病毒疫苗。

4　结 语

目前对PEDV S基因的研究，主要集中在基因结构分析及功能预测、蛋白免疫原性分析、遗传进化分析等方面。经重组菌或重组病毒等多种形式表达的S基因的多个保守性中和抗原表位，在经过以小鼠作为动物模型的试验中表现出良好的免疫原性的优势，但同时也存在不少令人担忧的问题，例如，重组菌或重组蛋白诱导细胞和体液免疫水平不够显著，与传统疫苗相比存在保护效力不足的缺点，新型诊断方法或疫苗在临床实践应用较少等。此外，虽已证实pAPN为PEDV细胞受体，但关于S蛋白与pAPN受体结合后如何进行一系列信号转导促使细胞膜重排和融合等机制还需进一步研究来揭示。